技术分享：抗体偶联药物ADC临床生物分析案例
更新时间：2024-11-28 13:51 浏览量：69
抗体偶联药物（ antibody drug conjugates，ADC）治疗是最近几十年发展最快的肿瘤治疗方法之一，结合了有效荷载的细胞毒性效应和单克隆抗体针对特定肿瘤细胞膜抗原的高特异性和选择性，在癌症领域显示出令人鼓舞的结果。
自2011年8月美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了首个ADC药物维布妥昔单抗（brentuximab vedotin，BV）以来，全球关于ADC药物研究和应用取得了迅猛发展。
1.ADC药物应用原理
与多数细胞毒性药物相同，ADC药物作为单一治疗的持续时间有限，因为耐药性和肿瘤的高异质性，要求从多角度攻击肿瘤细胞。
有证据表明，ADC能够有效提升免疫治疗剂的疗效[1]。ADC类药物一般由高特异性和高亲和力的抗体（抗体可以是嵌合抗体，也可以是抗体片段或双特异性抗体）、高稳定性的连接子和小分子细胞毒素组成。
连接子又可以分为可裂解型或不可裂解型。可裂解性的连接子利用体循环和肿瘤细胞之间的环境差异，能够准确释放游离的效应分子，同时分化为化学裂解连接子(腙键和二硫键)和酶裂解连接子(葡萄糖醛酸键和肽键)[2]；而不可裂解型的连接子通过降解抗体来释放效应分子。
小分子细胞毒素通常分为两类——靶向DNA的细胞毒素药和微管抑制剂[3]。常见的靶向DNA的细胞毒素有卡奇霉素(Cachimycin)、吡咯苯二氮杂卓（PBD）、杜卡霉素（Ducamycin）和喜数碱类（Camptothecin, CPT）、等；常见的微管抑制剂有金盏花素（MMAE，MMAF）、美登素衍生物（DM2，DM4）、微管溶素（Tubulysins）和隐粘菌素（Cryptomycins,CR）等。
抗体成分通过特异性识别靶细胞上的抗原，促进抗原-抗体偶联物的形成，并通过免疫机制与癌细胞和免疫细胞相互作用，如诱导免疫原性细胞死亡、树突状细胞成熟、T淋巴细胞浸润增加等，从而发挥抗肿瘤的作用。
首先通过单克隆抗体的靶向作用特异性的识别肿瘤表面抗原，通过内吞作用内化到达细胞，经内吞小体进入溶酶体，溶酶体的酸性环境和蛋白水解酶会致使ADC降解，释放的效应分子随后进入细胞质中，然后通过DNA插入或抑制微管合成等方式诱导肿瘤细胞凋亡。[4]
2.ADC药物不良反应
ADC有效载荷以生物活性形式释放并发挥作用，导致癌细胞死亡细胞内有效载荷的数量由每个细胞表面抗原的数量、每个ADC的药物有效载荷分子的数量（也称为药物抗体比率，DAR）以及抗原返回细胞表面所需的时间决定。
有效载荷可能在癌细胞死亡和降解后逃逸，也可能从胞浆中透膜而出。这种释放的后果可能是有益的（也称为旁观者效应），也可能是有害的，导致全身毒性。
随着ADC被积极地开发和广泛地应用，越来越多的临床研究结果显示ADC相关的肝毒性[5]、血液毒性[6]、眼毒性[7]、皮肤毒性[8]及胃肠道毒性[9]等，越来越多的临床研究结果显示ADC对神经系统也具有潜在毒性[10]。
3.临床样本分析
由于ADC分子的结构特异性，其药动学特征(PK)、毒理学机制及生物分析方法与单纯的大分子或小分子药物相比，更具复杂性和多样性，使其研发和临床试验面临巨大的挑战。
相对于小分子药物，ADC分布容积接近血浆体积，以及有限的组织分布（和单抗类似），半衰期长，其临床生物分析包含PK药代动力学、ADA抗药抗体以及Nab中和抗体分析。
2013年美国药学家协会（AAPS）发表了《Bioanalysis of antibody–drug conjugates: American Association of Pharmaceutical Scientists Antibody–Drug Conjugate Working Group position paper》白皮书[11]，在“ADC药物应该测定哪些生物分析物”的相关章节指出，对于ADC药物的PK分析，应该测定多种生物分析物用于评估ADC暴露量，总结了ADC生物分析通常需要测定的生物分析物以及相应的方法。
2024年3月FDA发布了《Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates Guidance for Industry》[12]，在第三章中生物分析方法（A. Bioanalytical Approach）指出，从首次人体试验开始，ADC及其组成部分应该通过验证试验进行测定。在后期，应该测量体循环中可以量化的ADC、其组成部分及其药理活性代谢物，以应用于暴露/反应分析。
其中LC-MS在ADC临床样本分析中有着极大的应用。如混合免疫亲和LC-MS/MS方法测定人体血浆中抗体偶联物PYX-201总抗体（Tab），通过胰蛋白酶对蛋白进行水解，并使用来自互补决定区（CDR）的具有10个氨基酸的特征肽段作为定量来自PYX-201的Tab替代物，
在ESI正离子模式下，分析物在人全血和血浆中均有极好的稳定性[13]；同时通过固液萃取(SLE)法萃取血浆中效应分子Aur0101，并完全验证了PYX-201的游离效应分子Aur0101在人血浆中的存在，以评估药物的安全性和有效性。同时证明Aur0101在不同的测试条件下，在人血浆和人全血中均稳定存在，并且不存在PYX-201。
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参考文献
[1]FUENTES-ANTRÁSJ,GENTA S,VIJENTHIRA A, et al. Antibody-drug conjugates：In search of partners of choice[J].Trends Cancer,2023,9 (4):339-354.
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[3] Norsworthy, K. J. et al. FDA approval summary: mylotarg for treatment of patients with relapsed or refractory CD33‐positive acute myeloid leukemia. Oncologist 23, 1103 (2018).
[4] Poon KA, Flagella K, Beyer J, Tibbitts J, Kaur S, Saad O, Yi JH, Girish S, Dybdal N, Reynolds T. Preclinical safety profile of trastuzumab emtansine (T-DM1): mechanism of action of its cytotoxic component retained with improved tolerability. Toxicol Appl Pharmacol. 273(2):298-313(2013).
[5] SUN C, YANG X, TANG L, et al. A pharmacovigilance study on drug-induced liver injury associated with antibody-drug conjugates (ADCs) based on the food and drug administration adverse event reporting system[J]. Expert Opin On Drug Saf, 2024, 23(8): 1049-1060.
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[7] RAHEEM F, ALSUHEBANY N, HICKEY ZACHOLSKI E, et al. Ocular toxicities associated with antibody drug conjugates and immunotherapy in oncology: clinical presentation, pathogenesis, and management strategies[J]. Expert Opin On Drug Saf, 2023, 22(10): 921-928.
[8] LACOUTURE ME, PATEL AB, ROSENBERG JE, et al. Management of dermatologic events associated with the nectin-4-directed antibody-drug conjugate enfortumab vedotin[J]. Oncologist, 2022, 27(3): e223-e232.
[9] SMITH P, LAVERY A, TURKINGTON RC. An overview of acute gastrointestinal side effects of systemic anti-cancer therapy and their management[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2020, 48-49: 101691.