小鼠维生素 D3（VD3）定量检测试剂盒（ELISA）使用指南
更新时间：2025-01-09
15:50 浏览量：23
在生命科学领域，对小鼠体内维生素 D3（VD3）含量的精准测定，是众多科研项目的关键环节。
实验原理
本试剂盒运用竞争 ELISA 法实现对小鼠维生素 D3（VD3）的定量检测。预先包被了维生素 D3（VD3）抗体的微孔板，就如同一个精心搭建的 “分子舞台”。实验开始时，样本或校准品与 Asaay Diluent 按照特定顺序依次加入这个 “舞台”。在温育过程中，样本或校准品中的 VD3 与包被抗体之间展开 “竞争” 结合。温育结束后，通过洗涤步骤，将未结合的物质彻底清除，为后续反应创造一个纯净的环境。
接着，加入 SA - HRP，它会与已经结合在抗体上的 VD3 进行特异性结合。再次洗涤后，加入底物 TMB。在适宜的室温条件下，TMB 在 SA - HRP 的催化作用下发生显色反应，溶液逐渐呈现出颜色变化。当加入终止液后，反应迅速终止，此时通过酶标仪读取 OD 值。值得注意的是，OD 值的高低与样品中维生素 D3（VD3）的含量呈现出负相关的关系，即样品中 VD3 含量越高，OD 值越低；反之，OD 值越高。凭借这一原理，本试剂盒能够精准地检测出血清中维生素 D3（VD3）的增减变化，为科研工作提供准确、可靠的数据支持。
试剂盒限制性
用途限制：本试剂盒明确仅用于科研领域，严禁用于临床诊断。这一限制是基于科学研究和临床应用的不同要求与标准，旨在确保实验结果的准确性和安全性。有效期使用：请严格在试剂盒标示的有效期内使用。过期的试剂盒可能由于试剂的变质、活性降低等原因，导致检测结果出现偏差，无法准确反映样本中 VD3 的真实含量。避免混用：为了保证检测结果的可靠性和稳定性，本试剂盒不能与其他厂家的试剂盒或组分混合使用。不同厂家的产品在试剂配方、生产工艺等方面可能存在差异，混合使用可能引发不可预测的化学反应，干扰实验结果，使实验数据失去参考价值。样本稀释：若样品需要稀释，可选用 PBS（PH7.4）进行稀释。PBS 溶液具有良好的缓冲性能，能够在稀释样品的同时，维持样品的稳定性和生物活性，确保检测结果不受稀释过程的影响。高浓度样本处理：若样本值高于最高标准品浓度值，为了获得准确的检测结果，需要将样本进行适当稀释后再重新测定。过高浓度的样本可能超出试剂盒的检测范围，导致检测结果不准确，稀释操作能够使样本浓度处于合适的检测区间内。干扰因素排除：待测样本中可能存在的异嗜抗体可能会干扰检测结果的准确性。在检测前，科研人员务必仔细排查并排除该因素，例如通过相关的预处理方法或使用特异性的阻断剂，以确保检测结果真实可靠。结果不可比性：由于不同检测方法的原理、灵敏度、特异性等方面存在差异，通过其他方法得到的检测结果与本试剂盒的测定结果不具有直接可比性。在科研过程中，应根据实验目的和要求，选择合适的检测方法，并在结果分析时充分考虑方法间的差异。
技术提示
避免气泡产生：在混合蛋白溶液时，要格外小心，尽量避免产生气泡。气泡的存在会影响溶液的均匀性，导致试剂在反应过程中的分布不均匀，进而对实验结果产生不利影响。因此，在操作过程中，应缓慢、轻柔地进行混合操作，避免剧烈振荡。防止交叉污染：加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分采用悬臂加样的方式。这一操作是防止交叉污染的关键环节，能够有效避免不同样本之间的相互干扰，确保实验数据的准确性和可靠性。严格控制温育和洗涤步骤：合适的温育时间和充分的洗涤步骤是保证实验结果准确的必要条件。温育时间过短，可能导致反应不充分，无法准确检测到样本中的 VD3；温育时间过长，则可能引起非特异性结合，影响检测结果的特异性。洗涤步骤同样重要，不充分的洗涤会导致残留的未结合物质干扰后续检测，因此务必严格按照说明书要求的时间和步骤进行操作。优化洗板操作：使用自动洗板机时，加入一个 30 秒浸泡的步骤，有助于提高洗板效果，进而提升检测精度。这一浸泡步骤能够使洗涤液充分与反应孔内的杂质接触，更有效地去除残留物质，减少背景干扰，提高检测的准确性。底物溶液状态判断：底物溶液正常情况下应为无色液体。若在保存过程中发现其变为蓝色，这表明底物溶液已经失效，不可再继续使用。失效的底物溶液无法准确反映检测结果，继续使用会导致实验数据的错误，因此在使用前应仔细观察底物溶液的状态。正确添加终止液：终止液的加样顺序应与底物溶液的加样顺序保持一致。加入终止液后，原本蓝色的底物产物会迅速变为黄色，这一颜色变化是反应正常进行的标志之一。正确的加样顺序和颜色变化能够确保实验结果的准确性和可靠性，科研人员应严格按照操作流程进行。妥善保存剩余板条：实验中用剩的板条，应立即放回自封袋中密封，并放置在低温干燥的环境下保存。这样可以防止板条受到外界环境因素的影响，如湿度、温度变化、微生物污染等，从而保持其性能的稳定性，以便在后续实验中继续使用。规范操作液体组分：所有液体组分在使用前都需要充分摇匀，确保溶液的均匀性。同时，要严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。任何一个环节的失误都可能导致实验结果出现偏差，因此科研人员在操作过程中应保持严谨的态度，仔细核对每一个步骤。
试剂盒组分与保存
未开封的试剂盒应妥善保存在 2 - 8 度的环境中，过期的试剂盒严禁使用。本试剂盒包含以下组分：
校准品：0.5ml / 管 * 6 管，由抗原精心配制而成，包含 6 个不同浓度的标准品，其浓度依次为 48、24、12、6、3、0ng/mL。这些标准品如同实验的 “标尺”，是绘制标准曲线的重要依据，通过与样本的检测结果进行对比，能够准确计算出样本中 VD3 的含量。包被微孔板：有 96T 和 48T 两种规格可供选择，预包被了固相抗体。这些微孔板为检测反应提供了固定的场所，如同一个个微小的 “反应容器”，确保检测反应能够在有序的环境中进行。SA - HRP：12mL，是 HRP 标记物，在检测过程中发挥着关键的识别和标记作用。它能够与已经结合在抗体上的 VD3 特异性结合，从而在后续的显色反应中发挥作用，使检测结果能够通过颜色变化直观地呈现出来。Asaay Diluent：12mL，主要用于分离 VD3 与结合蛋白，确保检测的准确性。它能够有效地打破 VD3 与结合蛋白之间的结合，使 VD3 能够自由地参与后续的检测反应，提高检测的灵敏度和特异性。TMB：12mL，TMB 工作液，在检测过程中通过显色反应来指示检测结果。它在 SA - HRP 的催化下发生颜色变化，为实验人员提供了直观的检测信号，方便判断实验结果。终止液：12mL，2mol/L 稀释液，用于终止显色反应，使检测结果得以稳定。在加入终止液后，反应迅速停止，颜色不再发生变化，此时的检测结果能够准确地反映样本中 VD3 的含量。20× 浓缩洗涤液：30mL，含有 0.15% Tween20 的 PBS。它在实验中用于清洗反应孔，去除未结合的物质，保证检测环境的纯净。稀释后的洗涤液能够有效地清洗掉反应过程中残留的杂质，减少背景干扰，提高检测的准确性。说明书：1 份，为实验人员提供详细的操作指导和相关信息。它涵盖了从实验准备到结果分析的每一个环节，是实验过程中不可或缺的重要参考资料，科研人员应仔细阅读并严格按照说明书的要求进行操作。自封袋：1 个，用于临时保存未使用完的板条，确保其性能不受影响。自封袋能够有效地隔绝外界环境的干扰，保持板条的稳定性，方便在后续实验中继续使用。不干胶：2 片，可用于标记或密封等操作。在实验过程中，科研人员可以使用不干胶对样本、试剂等进行标记，方便识别和管理；同时，也可以用于密封反应板，防止水分蒸发和外界污染。
需要特别注意的是，本品必须按照具有潜在感染性的物品进行处理，处理过程应严格遵循通用的安全措施。这是因为实验样本和试剂可能携带潜在的病原体，为了保障实验人员的安全和实验环境的卫生，必须采取相应的防护和处理措施。
其他用品
为了顺利完成实验，您还需要准备以下物品：
酶标仪（450nm）：用于准确测量吸光度，获取实验的关键数据。酶标仪能够精确地测量样本在特定波长下的吸光度，通过与标准曲线的对比，计算出样本中 VD3 的含量，是实验结果分析的重要工具。精密移液器及一次性吸头：确保加样的准确性和精确性，避免交叉污染。精密移液器能够准确地控制加样量，一次性吸头则可以防止不同样本之间的交叉污染，保证实验数据的可靠性。蒸馏水：用于稀释试剂等操作，保证实验的纯净性。蒸馏水具有良好的纯净度，能够在稀释试剂的过程中不引入杂质，确保实验结果不受其他因素的干扰。洗瓶或者自动洗板机：用于清洗反应孔，去除杂质，提高实验的准确性。洗瓶和自动洗板机都能够有效地清洗反应孔内的残留物质，减少背景干扰，提高检测的准确性和可靠性。37℃水浴锅或恒温箱：为实验提供适宜的温度环境，确保反应正常进行。在 37℃的环境下，各种生物化学反应能够在最适宜的温度条件下进行，保证实验结果的稳定性和可靠性。500ml 量筒：用于量取试剂，保证实验用量的准确性。量筒能够准确地量取一定体积的试剂，确保实验过程中试剂的用量准确无误，从而保证实验结果的可靠性。
生物安全
严格遵守实验室规范：整个检测过程必须严格符合实验室管理规范的要求，高度重视防止交叉污染。实验室管理规范是保障实验安全和结果准确性的基础，科研人员应严格遵守各项规定，确保实验操作的科学性和规范性。注意防腐剂的危害：试剂盒的液体组分中含有 proclin - 300 防腐剂，这种物质可能会引起皮肤过敏反应。在操作过程中，应避免吸入烟雾以及与皮肤接触。如不慎接触，应立即采取相应的处理措施，如用大量清水冲洗接触部位，并根据情况寻求医疗帮助。防止底物液的刺激：底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，操作时务必小心谨慎，避免吸入烟雾。若不小心接触到，应及时用大量清水冲洗，并根据情况寻求医疗帮助。在使用底物液时，应佩戴适当的防护装备，如手套、护目镜等，以保护自身安全。做好个人防护措施：在实验过程中，务必戴上防护手套，实验完成后要彻底洗手，清除可能残留的有害物质。防护手套能够有效地防止皮肤接触到有害物质，实验后的彻底洗手则可以进一步清除可能残留的化学物质，保障实验人员的身体健康。
样品的采集和储存
样本类型和采集
以下是不同样本类型的采集方法及注意事项，所有样本采集过程中严禁使用叠氮钠作为防腐剂。
细胞培养上清：将细胞培养上清液在 4000rpm 的条件下离心 20min，这样可以有效去除细胞颗粒和聚合物。处理后的上清液应保存在 - 20℃以下的环境中，同时要注意避免反复冻融，以免影响样本的稳定性。反复冻融可能导致样本中的蛋白质变性、降解等，从而影响检测结果的准确性。血清：使用不含热原和内毒素的试管进行血液采集，操作过程中要尽量避免对细胞产生刺激。采集后的血液在 4000rpm 条件下离心 20min，小心地分离出血清，将其保存在 - 20℃以下的环境中，同样要避免反复冻融。热原和内毒素可能会干扰实验结果，因此使用不含这些物质的试管能够保证样本的纯净性；避免对细胞产生刺激和反复冻融，则可以保证血清中 VD3 的稳定性。血浆：可选用肝素、EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂。在采集样品后，于 4000rpm 条件下离心 20 分钟，取上清液。血浆应保存在 - 20℃以下的环境中，防止反复冻融对样本造成损害。不同的抗凝剂适用于不同的实验需求，科研人员应根据实验目的选择合适的抗凝剂；而低温保存和避免反复冻融则是保证血浆样本质量的关键。组织：首先用预冷的 PBS (0.01 M,pH = 7.4) 冲洗组织，去除残留的血液。然后称重并将组织剪碎，按照大约 1: 9 的重量体积比（具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性），将剪碎的组织与 PBS 一同加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后，将匀浆液在 5000×g 的离心力下离心 5 - 10 分钟，取上清液进行检测。预冷的 PBS 能够清洗组织表面的杂质，保护组织中的蛋白质；合适的重量体积比和充分的研磨、裂解操作能够使组织中的 VD3 充分释放出来；离心操作则可以分离出上清液，用于后续的检测。
样本保存和稳定性
样本在 2 - 8℃条件下，可以短暂储存 72h；若要长期保存，可将样本置于 - 20℃的环境中，保存期限为 6 个月。如果样本收集后不能一次性完成检测，请按照一次用量进行分装冻存，避免反复冻融对样本造成影响。在使用时，将样本在室温下解冻，并确保样品均匀充分解冻，以保证检测结果的准确性。不同的保存条件适用于不同的实验需求，科研人员应根据实际情况选择合适的保存方式，同时注意避免反复冻融对样本造成的损害。
检验方法操作程序
试剂准备：将各种试剂提前移至室温环境下平衡两小时，使试剂达到最佳的反应状态。取适量浓缩洗涤液，根据当批检测的实际数量，用蒸馏水按照 1：20 的比例进行稀释，充分混匀后备用。试剂的平衡和稀释是实验的重要准备工作，能够确保试剂在实验过程中的稳定性和有效性。设置反应孔：从密封袋中小心取出预包被板，设置一个空白对照孔，此孔不添加任何液体。每个校准品设置 2 孔，每孔准确加入对应校准品 15μl；其余每个检测孔直接加入 15μl 待测血清或质控品。准确设置反应孔和加入相应的样品是实验的关键步骤，能够保证实验结果的准确性和可比性。温育反应：除空白孔外，向所有孔中加入 100μl Asaay Diluent，轻轻混匀后，贴上封板膜，将其放置在 37℃的环境中温育 60 分钟，让反应充分进行。温育过程是实验的核心环节之一，能够使样品中的 VD3 与试剂充分反应，为后续的检测奠定基础。洗板操作：手工洗板：小心弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置 10 秒后轻轻甩干，重复此操作 3 次，最后将板拍干。手工洗板需要实验人员具备一定的操作技巧和耐心，确保洗涤液能够充分接触反应孔内的杂质，同时避免过度甩干导致孔内液体残留。洗板机洗板：选择洗涤 3 次的程序进行洗板，洗板完成后将板拍干。洗板机洗板能够提高洗板的效率和一致性，减少人为误差，是一种较为常用的洗板方式。二次温育：向每孔（空白对照孔除外）加入 100μl SA - HRP，轻轻混匀后，再次贴上封板膜，置于 37℃环境中。
